Vrste hranljivih podloga. Posebne (elektivne) hranljive podloge Izborne hranljive podloge uključuju
Razvoj hranljivih podloga, a posebno gustih medija, za različite vrste mikroorganizama omogućio je proučavanje njihovih kulturnih, biohemijskih, antigenskih i virulentnih svojstava.
Pasteur je koristio tečne infuzije za uzgoj mikroba. Prvi kreatori čvrstih hranljivih podloga bili su Koch i njegovi učenici. Oni su prvi koristili krompir, zgrušanu surutku, želatin i agar sa ekstraktom mesa.
Čvrsti medij omogućio je dobivanje čistih kultura mikroba i proučavanje njihovih svojstava.
Postalo je moguće utvrditi etiološke faktore mnogih zaraznih bolesti i razviti preventivne i terapijske lijekove.
Uzgoj mikroba na čvrstim hranljivim podlogama u laboratorijskim uslovima omogućio je dobijanjem čistih kultura ne samo da se radi na stvaranju vakcina i dijagnostici, već i da se proučava spektar delovanja hemoterapeutskih lekova i antibiotika koji se koriste u terapijske svrhe, tj. kao i za proučavanje dejstva hemijskih lekova koji se koriste u preventivne svrhe, tekuću i završnu dezinfekciju.
Postavljanje laboratorijske dijagnoze povezano je sa razjašnjavanjem sistematskog položaja mikroorganizama dobijenih u čistoj kulturi (čista kultura je skup mikroba iste vrste na hranljivoj podlozi).
Dobijanje čiste kulture je često neophodan uslov prilikom proučavanja mikroorganizama izolovanih od pacijenta.
Određivanje vrste mikroorganizama uključuje određivanje niza karakteristika mikroorganizama: morfologije ćelija, prirode rasta kulture na različitim hranljivim podlogama, sposobnosti korišćenja određenih hemijskih jedinjenja, odnosa prema temperaturi, pH sredine, kiseonika itd. , da bi se odredile vrste mikroorganizama, često im je potrebno poznavati metaboličke produkte, antigena svojstva, nukleotidni sastav ćelija, biohemijsku aktivnost povezanu sa skupom enzima i još mnogo toga.
Određivanje svih ovih karakteristika omogućava identifikaciju mikroorganizama.
Identifikacija mikroorganizama je vrlo važna u dijagnostici infekcija, utvrđivanju izvora i puteva prijenosa patogena.
Da bismo mogli identificirati bilo koji mikroorganizam, potrebno je akumulirati jedinke u čistoj kulturi i u potrebnoj količini.
Za izolaciju, kultivaciju, akumulaciju i očuvanje mikroorganizama koriste hranljive podloge koje sadrže sve nutrijente neophodne za mikrobe i simuliraju stanište mikroorganizama u prirodnim uslovima.
Svi mediji kulture moraju ispunjavati sljedeće zahtjeve:
1) prisustvo hranljivih materija i faktora rasta u lako svarljivom obliku;
2) sterilitet – odsustvo živih mikroorganizama i spora;
3) izotoničnost - isti sadržaj mineralnih soli unutar i izvan ćelije. Za patogene mikroorganizme koji su se prilagodili dug boravak U ljudskom tijelu, 0,85% otopina natrijum hlorida smatra se izotoničnom. Za mikroorganizme koji žive, na primjer, u okeanu (slana voda), izotoničnost će se stvoriti različitom koncentracijom soli, ali zahtjev za izotoničnost hranljivih medija ostaje;
4) optimalni pH životne sredine. Redox potencijal hranljivog medija stvaraju vodikovi joni, što doprinosi normalnom funkcionisanju mikrobnih enzima;
5) transparentnost okruženja. Budući da većina bakterija, jedan od glavnih znakova rasta na hranjivim podlogama je zamućenost (na tekućim podlogama - zamućenost, sediment, film ili miješana; na čvrstim podlogama - stvaranje kolonija).
Najvažnija karakteristika rasta nekih mikroorganizama na hranljivim podlogama: za leptospire - odsustvo zamućenosti hranljive podloge (posmatranje rasta i razmnožavanja ovih mikroorganizama vrši se pomoću faznog kontrastnog mikroskopa), za mikoplazme i uzročnika uzročnik tuberkuloze - usporen rast (zamućenje ili pojava kolonija ne ranije od 21 dana, pa čak i kasnije).
Hranjive podloge su osnova mikrobiološkog rada i njihov kvalitet često određuje rezultate istraživanja. Stoga pri odabiru podloga treba voditi računa kako o zahtjevima mikroba u odnosu na tvari potrebne za održavanje njihovih vitalnih funkcija, tako i o njihovoj sposobnosti da u datim uvjetima vrše razmjenu tvari između ćelije i okoline.
Hranljivi mediji moraju stvarati optimalne (najbolje) uslove za život mikroba.
Da bi izvršila biosintezu, rast i reprodukciju, stanica mora primiti izvana u potrebnim količinama sve elemente koje sadrži i mora joj biti snabdjeven izvor energije. U skladu s tim koji se elementi tačno isporučuju u ćeliju, tvari hranljivog medija nazivaju se izvorima ugljika, dušika, fosfora, sumpora itd.
Jedinjenja u obliku kojih se elementi neophodni za konstruktivne svrhe moraju uneti u medije određuju sintetičke sposobnosti mikroorganizama.
Oblik izvora energije određen je načinom njegove proizvodnje.
Sintetičke sposobnosti mikroorganizama i načini na koje dobijaju energiju su izuzetno raznoliki, a samim tim i njihove potrebe za izvorima hrane. Ovu činjenicu treba uzeti u obzir prilikom pripreme hranljivih podloga, jasno shvaćajući da univerzalne podloge koje su podjednako pogodne za rast svih mikroorganizama bez izuzetka ne postoje.
Dakle, sastav hranljivih podloga determinisan je prvenstveno karakteristikama i raznovrsnošću metabolizma mikroorganizama.
Neophodni nutritivni elementi za mikroorganizme, kao i za druga bića, su ugljik, dušik, sumpor, fosfor, pepeo, a za mnoge mikroorganizme razni dodatni nutrijenti kao što su vitamini, faktori rasta itd.
Mnogi mikroorganizmi, poput viših životinja, osim normalnih izvora ugljika, dušika, mineralnih soli i drugih elemenata koji im služe kao izvor energije i materijala za sintezu, zahtijevaju i vrlo značajne faktore rasta. Karakteristika faktora rasta je njihova aktivnost u izuzetno malim količinama.
Faktor rasta je prvi otkrio Wilde 1901. dok je uzgajao kvasac. Primijetio je da kada se sintetički medij inokulira s malom količinom kvasca, nije uočen rast. Međutim, ako se istovremeno sa sjetvom kvasca u hranljivu podlogu doda kvasac koji je umro kuhanjem, dolazi do rasta. Vajld je ovaj fenomen objasnio prisustvom određenog faktora rasta u ćeliji kvasca, koji je nazvao "BIOS".
Studija prirode BIOS-a pokazala je da se radi o mješavini nekoliko komponenti. BIOS je podijeljen na dvije frakcije “BIOS”-1 i “BIOS”-2. Obje frakcije, uzete odvojeno, su neaktivne. Njihova sposobnost da stimulišu rast mikroba javlja se samo kada djeluju zajedno. "BIOS"-1 je inozitol, "BIOS"-2 sadrži heterociklični prsten sa slobodnom karboksilnom grupom.
Ispostavilo se da su supstance slične BIOS-u neophodne kao faktori rasta za mnoge mikroorganizme. Neki mikroorganizmi zahtijevaju dodavanje vitamina B u hranljivu podlogu.
Bakterije se prema potrebi za vitaminom B dijele u četiri grupe:
a) bakterije koje rastu u bujonu bez vitamina B. Ove bakterije ne rastu u sintetičkim medijima (bacili tifusa i dizenterije, piogeni stafilokok);
b) bakterije koje ne zahtijevaju egzogenu opskrbu vitaminom B. Ove bakterije rastu u bezvitaminskoj juhi i sintetičkim podlogama (Escherichia coli, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, antraks, itd.). Mikrobi ove grupe su u stanju da sami sintetiziraju vitamin B;
c) bakterije koje se slabo razvijaju na podlozi bez vitamina (meningokok, uzročnik difterije);
d) bakterije koje ne rastu na podlozi bez vitamina (hemolitički streptokok, pneumokok).
Utvrđeno je da vitamini B imaju sposobnost stimulacije rasta i stvaranja kiseline u propionskoj kiselini i bakterijama mliječne kiseline.
Bacil gripe, uzročnik velikog kašlja i šankroida, zahtijeva faktor rasta koji se sastoji od X i Y faktora. Oba ova faktora nalaze se u krvi, kao iu krompiru i drugim biljnim ekstraktima.
X faktor je termostabilan, hematin i može se zamijeniti nekim neorganskim spojevima željeza koji imaju oksidnu ili katalaznu aktivnost. Hematin i druga jedinjenja željeza neophodni su za sintezu citokroma uključenih u procese disanja.
Y faktor ima vitaminsku prirodu, uništava se tokom autoklaviranja, a proizvode ga bakterije, kvasac, životinjske i biljne ćelije.
Anaerobni mikrob Bac. sporogenes koristi nezasićene masne kiseline kao faktor rasta. Njegovo prisustvo je takođe neophodno za rast Cl.botulinum i Cl. Perfringens. Ovu tvar stvaraju mnoge aerobne bakterije, na primjer, tifus, bacili tuberkuloze i gljivice plijesni. Očigledno, ova supstanca je neophodna za život svih mikroorganizama, ali anaerobne klostridije nemaju sposobnost da je same sintetiziraju.
Vrlo aktivan faktor rasta sa univerzalnom biološkom distribucijom je pantotenska kiselina. Amid nikotinske kiseline služi kao faktor rasta za stafilokoke. Bez toga, stafilokoki ne rastu na sintetičkim podlogama koje sadrže hidrolizirani želatin, triptofan, tirozin, cistin i glukozu. Nikotinamid sintetiziraju crijevni i tifusni bacili, kao i Vibrio cholerae.
Faktori rasta uključuju neke aminokiseline (neophodne za sintezu proteina), purinske i pirimidinske baze (koriste se za izgradnju nukleinskih kiselina) itd. Mnogi faktori rasta su dio različitih enzima i igraju ulogu katalizatora u biološkim procesima. Pitanje faktora rasta bakterija je veoma važno. S jedne strane, pomaže u razumijevanju fiziološke uloge mesne vode, koja se koristi za pripremu laboratorijskih hranjivih podloga za uzgoj mnogih mikroorganizama. S druge strane, rješavanje pitanja faktora rasta omogućava širu upotrebu sintetičkih podloga za uzgoj mikroba.
Hranljivi mediji za isti mikroorganizam mogu se razlikovati ovisno o ciljevima studije. Na primjer, podloge pogodne za dugotrajno održavanje vitalne aktivnosti mikrobnih kultura mogu se uvelike razlikovati od medija namijenjenih proizvodnji određenih metaboličkih proizvoda, kada je potrebno stimulirati određene aspekte vitalne aktivnosti mikroba. Za formiranje spora i drugih oblika životnog ciklusa potrebna su posebna okruženja.
Ako je moguće, hranljive podloge treba da budu standardizovane, odnosno da sadrže stalne količine pojedinačnih sastojaka. Radi lakšeg praćenja rasta useva i praćenja kontaminacije životne sredine stranim mikroorganizmima, hranljivi mediji moraju biti transparentni.
Na osnovu svog sastava, hranljivi mediji se dele na prirodne, sintetičke i polusintetičke.
Prirodnim medijima se obično nazivaju mediji koji se sastoje od proizvoda životinjskog ili biljnog porijekla i imaju složen, neizvjestan hemijski sastav. Osnova takvih medija su razni dijelovi zelenog bilja, životinjskog tkiva, slada, kvasca, voća, povrća, stajnjaka, tla, morske vode, jezera i mineralnih izvora. Većina ih se koristi u obliku ekstrakata ili infuzija.
Mnogi mikroorganizmi se dobro razvijaju u prirodnim medijima, jer takvi mediji u pravilu sadrže sve komponente potrebne za rast i razvoj mikroba. Međutim, podloge nesigurnog sastava su od male koristi za proučavanje fiziologije metabolizma mikroorganizama, jer ne dozvoljavaju da se uzme u obzir potrošnja određenog broja komponenti podloge i da se otkrije koje tvari nastaju tokom razvoj mikroorganizama.
Prirodni mediji nesigurnog sastava koriste se uglavnom za održavanje kultura mikroorganizama, akumulaciju njihove biomase i u dijagnostičke svrhe.
Mediji nesigurnog sastava uključuju i tzv. polusintetičke medije. Njihov sastav, zajedno sa spojevima poznate hemijske prirode, uključuje supstance nesigurnog sastava. Takvi mediji se posebno koriste u industrijskoj mikrobiologiji za proizvodnju aminokiselina, vitamina, antibiotika i drugih važnih produkata mikrobnog djelovanja.
Primjer takvog medija je mesni peptonski bujon (MPB), koji, uz ekstrakt mesa i pepton, koji imaju složen sastav, uključuje natrijum hlorid, kalijev fosfat, a ponekad i glukozu ili saharozu. U polusintetičke podloge spadaju i podloga krompira sa glukozom i peptonom.
Sintetički mediji su mediji koji sadrže samo određene, kemijski čiste spojeve uzete u točno određenim koncentracijama.
Sintetički mediji su najpogodniji za proučavanje metabolizma mikroorganizama. Poznavajući tačan sastav i količinu komponenti uključenih u životnu sredinu, moguće je proučavati njihovu potrošnju i transformaciju u odgovarajuće metaboličke produkte.
Hranjivi mediji mogu biti selektivni, diferencijalno dijagnostički i konzervansi.
Izborne medije u mikrobiološku praksu uveli su S.N. Vinogradsky i M. Beyerinck. To su hranljive podloge u kojima se dodavanjem jednog ili više hemijskih jedinjenja stvaraju optimalni uslovi za rast i razmnožavanje jedne vrste mikroorganizama (ili grupe srodnih mikroorganizama), a nepovoljni uslovi za sve ostale. Takve podloge se uglavnom koriste za izolaciju čiste kulture mikroorganizama iz njihovih prirodnih staništa i za akumulaciju mase kultura (hemijska metoda za izolaciju čiste kulture). Na primjer, hranljiva podloga, a to je koagulirani konjski serum, je selektivna podloga za bakterije difterije, alkalna peptonska voda za Vibrio koleru, žučna juha za uzročnika trbušnog tifusa, jetrena juha za Brucella itd.
Akumulacija mikroba u selektivnim hranjivim podlogama u mnogim slučajevima služi kao važan preliminarni korak u izolaciji čistih kultura od originalnih test materijala (na primjer, Vibrio cholerae ili tifusne bakterije iz fecesa pacijenata ili nositelja, itd.).
Diferencijalni dijagnostički mediji su oni mediji koji, pored tvari koje osiguravaju rast i razvoj mikroorganizama, uključuju tvari koje se koriste kao supstrat za određene enzime. Na osnovu kvalitativne promjene u supstratu utvrđuje se prisustvo određenog enzima (procjenjuje se pomoću indikatora koji reaguje na prisustvo produkata raspadanja supstrata u hranljivom mediju).
Svaki tip mikroorganizma karakterizira prilično stabilan skup enzima. Određivanje skupa enzima pomoću diferencijalno dijagnostičkih medija omogućava razlikovanje tipova mikroorganizama. Na primjer, krvni agar vam omogućava da otkrijete enzim hemolizin, His medij - saharolitičke enzime (ugljikohidrate), želatin se koristi za uzimanje u obzir proteolitičkih svojstava mikroba itd.
Krvni agar. Prisutnost enzima hemolizina procjenjuje se uništavanjem crvenih krvnih stanica i formiranjem svjetlosne zone oko mikroba uzgojenih na krvnom agaru.
Njegovi mediji. Prisustvo enzima - karbohidrata, koji razgrađuju ugljikohidrate u kiselinu, ukazuje se promjenom pH podloge prema kiseloj strani i promjenom boje hranljive podloge. Razlika u setu enzima može se koristiti za provjeru čistoće izolirane kulture, kao i za brzo razlikovanje jedne vrste od drugih tokom početnog proučavanja inokulacije infektivnog materijala.
Sredstva za konzerviranje su namijenjena primarnoj sjetvi i transportu ispitnog materijala. Sprječavaju smrt patogenih mikroorganizama i potiskuju razvoj saprofita. Primjer je mješavina glicerina koja se koristi za sakupljanje stolice u testovima za otkrivanje određenih vrsta bakterija.
Na osnovu fizičkog stanja, mediji se dijele na tekuće, guste, polutečne i zrnate. Za pojašnjenje fizioloških i biohemijskih karakteristika mikroorganizama, kao i za akumulaciju njihove biomase ili metaboličkih proizvoda, najpogodnije je koristiti tečne medije. Čvrste podloge se koriste za izolaciju čistih kultura, dobijanje izolovanih kolonija, skladištenje kultura i kvantifikovanje mikroorganizama, određivanje njihovih antagonističkih svojstava iu nizu drugih slučajeva. Polučvrste podloge za kulturu se obično koriste za dugotrajnije skladištenje mikrobnih kultura. Za kompaktiranje medija koristi se agar - agar, želatina i gel silicijske kiseline.
U industrijskoj mikrobiologiji koriste se takozvani rasuti hranljivi mediji. Takvi mediji uključuju, na primjer, kuhano proso, mekinje natopljene hranljivim rastvorom itd.
Hranljivi mediji mogu biti jednostavni ili složeni. Jednostavni tečni hranljivi mediji uključuju peptonsku vodu, mesno peptonsku supu (MPB). Gusti jednostavni hranljivi mediji uključuju meso - pepton agar (MPA) i meso - pepton želatin.
Jednostavne hranljive podloge, posebno MPB i MPA, služe kao osnova za izradu složenijih podloga od njih dodavanjem različitih supstanci koje povećavaju nutritivnu vrednost supstrata. Na primjer, dodavanjem glukoze nastaje šećerna juha ili šećerni agar; ascites - agar i ascites - bujon se dobijaju dodavanjem ascitne tečnosti; Puna krv je komponenta krvnog agara i krvnog bujona, a dodavanjem krvnog seruma nastaje serumski medij (agar ili bujon).
Podloge složenijeg sastava obično su namijenjene za uzgoj mikroba koji su zahtjevni za hranljive supstrate i koji se ne razmnožavaju na jednostavnim podlogama. Takvi mikroorganizmi uključuju patogene gonoreje, difterije, bruceloze, tularemije, sifilisa, povratne groznice, rinoskleroma, tuberkuloze itd.
Na osnovu svoje namjene, hranljivi mediji se dijele u sljedeće glavne kategorije.
Universal- podloge na kojima dobro rastu mnoge vrste patogenih i nepatogenih bakterija. To uključuje: mesno-peptonski bujon (MPB = mesna voda + 1% peptona + 0,5% NaCl), mesno-peptonski agar (MPA = MPB + 2-3% agar).
Diferencijalna dijagnostika- mediji koji omogućavaju da se jedna vrsta bakterija razlikuje od druge po njihovoj enzimskoj aktivnosti ili kulturnim manifestacijama. To uključuje Endo, Levin, Ploskirev, Gissa i mnoge druge.
Selektivno(sinonimi: selektivno, elektivno, obogaćivanje) - podloge koje sadrže supstance koje koriste mikroorganizmi određenih vrsta, a ne doprinose ili čak sprečavaju rast drugih mikroorganizama. Selektivni mediji omogućavaju specifično odabiranje određenih vrsta bakterija iz materijala koji se proučava. To uključuje Mullerovu, selenit, Rapoport, 1% peptonsku vodu, itd.
Diferencijalno-selektivni- okruženja koja kombinuju svojstva diferencijalne dijagnostičke i selektivne sredine. Koriste se, posebno, za ubrzavanje otkrivanja i identifikacije bakterija koje pripadaju velikom broju rasprostranjenih vrsta enterobakterija i pseudomonada (okolina Sivolodskog).
Poseban- podloge posebno pripremljene za postizanje rasta onih bakterija koje ne rastu ili rastu vrlo slabo na univerzalnim podlogama. To uključuje McCoy-Chapin medij (za dobivanje rasta uzročnika tularemije), MPA u krvi (za dobivanje rasta patogenih streptokoka), Lowenstein-Jensen medij (za izolaciju uzročnika tuberkuloze) itd.
Sintetički- strogo definisano okruženje hemijski sastav, koji su rastvori neorganskih soli sa dodatkom hemijskih jedinjenja koja služe kao izvor ugljenika ili azota. Primjer takvog sintetičkog medija je minimalni medij M-9, u kojem je izvor energije i ugljika glukoza, a dušik NH4C1. Sintetički mediji mogu biti složenijeg sastava sa uključivanjem različitih aminokiselina, baza i vitamina.
Polusintetički- sintetički medij u koji se dodaje neki proizvod prirodnog porijekla, na primjer krvni serum. Postoji mnogo različitih opcija medija za kulturu dizajniranih da zadovolje potrebe relevantnih bakterijskih vrsta i dijagnostičke svrhe.
Asinhroni elektromotor a4 dizajniran je za pogon mehanizama koji ne zahtijevaju podešavanje brzine (ventilatori, dimovodne cijevi, pumpe). Karakteristike motora serije A4 i njihove karakteristike možete saznati na
Hranljivi mediji u mikrobiologiji su supstrati na kojima se uzgajaju mikroorganizmi i kulture tkiva. Koriste se u dijagnostičke svrhe, izolaciju i proučavanje čistih kultura mikroorganizama, proizvodnju vakcina i lijekova, te u druge biološke, farmaceutske i medicinske svrhe.
Klasifikacija mikrobioloških podloga
U mikrobiologiji hranljive podloge se dele na:
- sredine određenog i neodređenog sastava;
- prirodni, polusintetički i sintetički;
- osnovni, dijagnostički, izborni;
- gusta, polutečna, tečna, suva, zrnasta.
Prirodni hranljivi mediji su oni koji se dobijaju iz prirodnih materijala: krvi, mesa, proteina, životinjskih organa, biljnih ekstrakata i biljnih materijala. Primjeri takvih medija uključuju mesni bujon, surutku, pivsku sladovinu, infuzije sijena, agar-agar, krv i žuč. Prirodni mediji se odnose na medije nesigurnog sastava, koji drugačije vrijeme može imati različite količine određene komponente.
Polusintetički mediji se također smatraju medijima nesigurnog sastava. Pripremaju se na bazi prirodnih hranjivih podloga, ali im se dodaju tvari koje garantuju aktivnu reprodukciju usjeva. Usjevi se uzgajaju na polusintetičkim podlogama za proizvodnju vitamina, aminokiselina i antibiotika za industrijske farmaceutske proizvode.
Sintetički mediji se pripremaju od sastojaka poznatog sastava, u poznatim koncentracijama i omjerima, pa ovi mediji spadaju u medije određenog sastava. Uz njihovu pomoć proučavaju metabolizam mikroorganizama, njihov biološki i fiziološka svojstva, mogućnost dobijanja supstanci koje potiskuju ili, obrnuto, stimulišu njihov razvoj.
Osnovne, elektivne i dijagnostičke podloge
Osnovne podloge se koriste za uzgoj različitih mikrobnih kultura, kao i kao osnova za dobijanje elektivnih i dijagnostičkih podloga. Osnovni mediji, na primjer, uključuju mesni bujon, mesni agar, sladovinu i Hottinger bujon. Za različite usjeve, neke komponente se dodaju osnovnim podlogama za stimulaciju rasta - to mogu biti vitamini, aminokiseline i prirodni ekstrakti. Tako se uzročnik velikog kašlja uzgaja na podlozi uz dodatak krvi.
Izborna podloga - podloga za selektivni (selektivni) uzgoj bioloških kultura. Sastav podloge se bira tako da bude optimalan za jednu vrstu ili grupu blisko srodnih bakterija i da suzbije razvoj bakterija drugih vrsta. Na primjer, dodavanjem natrijum hlorida u medijum 
u određenoj koncentraciji inhibira rast svih bakterija osim stafilokoka. Uz pomoć izbornih kultura dobijaju se čiste kulture za dalje razmnožavanje i akumulaciju.
Dijagnostički mediji se koriste za identifikaciju mikroorganizama. Na osnovu promena u medijumu i njegovom hemijskom sastavu (promena boje medijuma, pojava mehurića gasa i sl.), određuje se vrsta bakterije. Takvim medijima se često dodaju hemijske indikatorske boje kao što su kristalno ljubičasta, malahit zelena, metilensko plavo, fusin i druge. Oni pomažu razdvajanju bliskih kultura. Na primjer, u ružičastom mediju Endo, obojenom fuzinom, E. coli stvara crvene kolonije, a kolonije bakterija tifusa i dizenterije su bezbojne.
Hranljivi mediji su osnova bakterioloških istraživanja. Oni služe za izolaciju čistih kultura mikroba iz materijala koji se proučava i za proučavanje njihovih svojstava. Hranljivi medij stvara optimalne uslove za razmnožavanje mikroorganizama. Mediji moraju sadržavati supstance neophodne za izgradnju svih komponenti citoplazme, tj. svi izvori rasta živog organizma. To prvenstveno uključuje izvore dušika, ugljika, vodonika i kisika.
Izvor vodonika i kiseonika u hranljivim medijima je voda. Izvor azota su organska jedinjenja koja se dobijaju iz mesa, ribe, placente, mleka, jaja i krvi. Kao rezultat hidrolize pankreatinom ili tripsinom, ovi proizvodi proizvode tzv. hidrolizati koji sadrže veliku količinu aminokiselina i peptona, koje većina mikroorganizama dobro apsorbira. Prirodni protein probavljaju samo neki mikroorganizmi koji imaju egzoproteaze. Hidrolizati su osnova za pripremu podloga za mnoge mikroorganizme.
Izvor ugljika za patogene mikrobe su uglavnom različiti ugljikohidrati: mono- i disaharidi, polihidrični alkoholi, organske kiseline i njihove soli.
Pored organogena, bakterijama su potrebna i anorganska jedinjenja koja sadrže fosfor, kalij, sumpor, natrijum, magnezijum, gvožđe, kao i mikroelemente: kobalt, jod, mangan, bor, cink, molibden, bakar itd.
Potrebe mikroorganizama za anorganskim jedinjenjima zadovoljavaju se dodavanjem soli KH2PO4 K2HPO4 i drugih u hranljivi medij. Mikroelementi koji djeluju kao katalizatori kemijskih procesa potrebni su u zanemarljivim količinama i ulaze u hranljivi medij sa peptonom, anorganskim solima i vodom. Uz navedene organske elemente, mnogim mikroorganizmima su potrebni faktori rasta, tj. u tvarima koje sami ne mogu sintetizirati. Faktori rasta moraju se dodati hranjivim podlogama u gotovom obliku. Faktori rasta uključuju različite vitamine čiji su izvor u hranljivim medijima proizvodi biljnog i životinjskog porijekla dodani u hranljivu podlogu, koji sadrže nikotinsku, pantotensku, parabenzojevu kiselinu, vitamine A, B, C itd.
Hranjive materije mikrobi mogu apsorbovati samo pod određenom reakcijom okoline, jer propusnost mikrobnih staničnih membrana se mijenja u zavisnosti od pH okoline.
Zahtjevi za hranljive podloge.
1. Podloga za uzgoj mora sadržavati hranjive tvari potrebne za hranjenje mikroba.
2. Imati pH reakciju koja je optimalna za vrstu mikroba koji se uzgaja. -
3. Hranljivi mediji moraju imati dovoljnu vlažnost i viskoznost, jer mikrobi se hrane u skladu sa zakonima difuzije i osmoze.
4. Biti izotoničan i imati određeni redoks potencijal (rH2).
5. Podloga za uzgoj mora biti sterilna, čime se osigurava mogućnost uzgoja čistih kultura.
Nutritivni i fizički zahtjevi za razne vrste mikrobi nisu isti, a to isključuje mogućnost stvaranja univerzalnog hranjivog medija.
Na osnovu konzistencije, razlikuju se čvrsti i tečni hranljivi mediji. Gusti se pripremaju na bazi tekućih dodavanjem adhezivnih tvari: agar-agar ili želatina! Agar-agar (žele na malajskom) je proizvod biljnog porijekla, ekstrahiran iz morskih algi. Agar-agar se otapa u vodi na temperaturi od 80-86°C, stvrdne na 36-40°C, te se stoga koristi za kompaktiranje hranjivih podloga za uzgoj. različite grupe mikroorganizme na njihovoj optimalnoj temperaturi.
Hranljive podloge se klasifikuju prema svom sastavu i namjeni.
1.Na osnovu sastava hranljive podloge se dele na jednostavne i složene
Postoji grupa okruženja opće namjene- jednostavno. U ovu grupu spadaju mesno-peptonski bujon (jednostavna hranljiva juha), mesno-peptonski agar (jednostavan hranljivi agar), hranljivi želatin. Ovi mediji se koriste za uzgoj mnogih patogenih mikroba. Podloge opšte namene, ili jednostavne hranljive podloge, obično se pripremaju od hidrolizata uz dodatak peptona i natrijum hlorida. Koriste se i kao osnova za pripremu složenih medija.
2. U drugu grupu spadaju elektivna, specijalna i diferencijalna dijagnostička okruženja.
Elektivna okruženja (selektivna, selektivna, akumulacija, obogaćivanje). Princip stvaranja selektivnih hranljivih podloga zasniva se na zadovoljavanju osnovnih biohemijskih i energetskih potreba vrste mikroba za koju su namenjene za uzgoj, odnosno na dodavanju inhibitora koji suzbijaju rast prateće mikroflore. Određeni sastav i koncentracija hranljivih materija, mikroelemenata, faktora rasta pri strogo definisanoj pH vrednosti ili dodatkom inhibitora obezbeđuju optimalne uslove za uzgoj jedne ili više vrsta mikroorganizama. Prilikom sjetve materijala koji sadrži mješavinu različitih mikroba, prvi će uvenuti rast vrsta za koje će okruženje biti selektivno. Primjeri elektivnih medija su juha od žumanca, juha od selenita, Ploskirev medij - za uzgoj mikroba iz crijevne porodice, alkalna peptonska voda - za Vibrio cholerae.
Čorba od žumanca. MPB se dodaje 10-20% volovske žuči. Žuč potiskuje rast koka i zračne flore, ali je povoljna za razmnožavanje salmonele.
Selenit bujon. Sastoji se od fosfatne juhe sa dodatkom natrijeve soli selenita, koja je inhibitor rasta kokalne flore i Escherichia coli, ali ne inhibira rast salmonele.
srijeda Ploskireva. Gusti medij koji sadrži inhibitore E. coli, coli, ali je povoljan za rast Shigella i Salmonella, čiju reprodukciju ne inhibiraju briljantna zelena i žučne soli.
Peptonska voda. Sadrži 1% peptona i 0,5% natrijum hlorida. Okolina je selektivna za vibrione hlora, jer umnožavaju se bolje od drugih bakterija u "gladnim sredinama", posebno u alkalnoj reakciji, jer same luče kisele otpadne proizvode.
Posebna okruženja. Neophodan za uzgoj bakterija koje ne rastu na jednostavnim hranjivim podlogama. Za neke organizme potrebno je dodati ugljikohidrate, krv i druge dodatne hranjive tvari u jednostavne hranljive podloge. Primjeri jednostavnih hranjivih podloga su šećerna juha i šećerni agar za streptokoke (pripremljeni od MPB i MPA, u koje se dodaje 0,5-2% glukoze).
Za pneumokoke i meningokoke poseban medij je juha od surutke i agar od surutke (za pripremu čorbe od surutke 1 dio MPB se pomiješa sa 2 dijela svježeg seruma; da se dobije whey agar u rastopljeni se dodaje 10-25% sterilnog konjskog ili goveđeg seruma MPA).
Diferencijalni dijagnostički mediji se koriste za određivanje vrste mikroba koji se proučava, na osnovu karakteristika njegovog metabolizma.” Prema svojoj namjeni, diferencijalno dijagnostička okruženja se dijele na sljedeći način:
1. Podloga za utvrđivanje proteolitičke sposobnosti mikroba, koja sadrži mlijeko, želatin, krv itd.
2. Mediji sa ugljikohidratima i polihidričnim alkoholima za
otkrivanje različitih saharolitičkih enzima.
Indikatori se dodaju u sastav diferencijalnih dijagnostičkih medija dizajniranih da identifikuju saharolitička svojstva i redoks enzime: neutralna crvena, kiseli fuksin, bromotimol plava, vodena plava sa ružičastom kiselinom (BP). Promjenom svoje boje pri različitim pH vrijednostima, indikator ukazuje na prisustvo enzima i razgradnju sastojka unesenog u podlogu.
Primjeri diferencijalno dijagnostičkih okruženja:
Endo okruženje. Sastoji se od MPA sa dodatkom 1% laktoze i bazičnog fuksina (indikatora) obezbojenog natrijum sulfitom. Endo medij ima blago ružičastu boju. Koristi se u dijagnostici crijevne infekcije za razlikovanje bakterija koje razgrađuju laktozu i formiraju kisele produkte od bakterija koje nemaju tu sposobnost. Kolonije mikroba pozitivnih na laktozu (Escherichia coli) su crvene zbog smanjenja fuksina. Kolonije laktoza-negativnih mikroorganizama - salmonele, šigele itd. - su bezbojne.
Diferencijalna dijagnostička okruženja uključuju kratku i proširenu šaroliku seriju. Sastoji se od medija sa ugljikohidratima (Hiss media), MPB, mlijeka i mesno-peptonskog želatina.
Hiss podloga se priprema na bazi peptonske vode u koju se dodaju hemijski čisti mono-, di- ili polisaharidi (glukoza, laktoza, skrob itd.).
Za detekciju pH pomaka kao rezultat stvaranja kiselina i razgradnje ugljikohidrata, u mediju se dodaje indikator. Dubljom razgradnjom ugljikohidrata nastaju plinoviti produkti (CO2, CH4, itd.) koji se hvataju pomoću plovaka - malih epruveta spuštenih naopako u medij. Podloge sa ugljikohidratima mogu se pripremiti i kao guste podloge uz dodatak 0,5-1% agar-agara. Tada se detektuje formiranje gasa formiranjem mjehurića (pukotina) u stupcu medija.
Na MPB, koji je dio šarolike serije, pronađeni su proizvodi koji nastaju razgradnjom aminokiselina i peptona (indol, sumporovodik). Vodonik sulfid se detektuje stavljanjem trake filter papira namočenog u rastvor olovnog acetata u MPB nakon sjetve kulture. Kada se aminokiseline koje sadrže sumpor razgrađuju, oslobađa se sumporovodik, a papir postaje crn zbog stvaranja olovnog sulfida. Za određivanje indola može se koristiti složeni indikator. Indol nastaje razgradnjom triptofana i može se otkriti kada se ovaj indikator doda kulturi uzgojenoj na MPB. U prisustvu indola, MPB postaje zelen ili plav.
Suva okruženja.
Hranljivi agar, kao i glavni diferencijalno dijagnostički mediji, trenutno se proizvode u obliku suhih preparata koji sadrže sve potrebne komponente. Takvim prašcima samo treba dodati vodu i prokuhati, a zatim ih, nakon sipanja, sterilizirati.
Podloga za uzgoj anaerobnih mikroba.Kineska mesno-peptonska juha od jetre - Tarozzi (MPPB). Svježa ili smrznuta jetra (najbolje od goveda) isječe se na male komadiće, prelije sa jednakom količinom vode iz slavine, kuha sat vremena, filtrira kroz vatu i u 1 dio dobivenog ekstrakta doda 3 dijela mesno-peptonske juhe. Smjesa se zagrije do ključanja, doda se hemijski čista kuhinjska so (1,25 g na 1 litar medija) i pH se podesi na 7,6-7,8, zatim se kuva 15 minuta i filtrira kroz papirni ili navlaženi pamučni filter. U procijeđenu juhu dodaju se sitno isjeckani komadi (1,5-2 g) jetre, u količini od 100 g jetre na 1 litar juhe (jetra se prvo očisti od filma i opere vodom). Nekoliko takvih komada se stavlja u epruvetu, 7-10 ml juhe se sipa u visoku kolonu, a na njenu površinu se nanosi vazelin ili parafinsko ulje.
Bujon s komadićima jetre sterilizira se pod suvišnim pritiskom od 0,1 MPa V 30 minuta. Da bi se uklonio kiseonik iz epruvete pre inokulacije, medijum se kuva 10 minuta i brzo se ohladi vodom.
Polučvrsti agar za anaerobe. MPB-u se dodaje 0,25-0,75% agar-agara i 1% glukoze; pH okoline je 7,4. Medij se sipa u epruvete u visokim stubovima. Sterilizirajte parom pare 15-20 minuta 3 dana.
Podloga za uzgoj bakterija mliječne kiseline.Mlijeko (cijelo). Zagrijte do ključanja. Sipati u tubu bocu i staviti na hladno mesto 10-20 sati da se krema slegne. Nakon ovog vremena, obrani dio mlijeka se sipa kroz epruvetu u epruvete i zatvara pamučnim čepovima. Sterilizirajte frakciono na 100°C tri dana po 20 minuta ili na 112°C jednom u trajanju od 30 minuta.
Obrano mlijeko. Da bi se dobilo obrano mlijeko, punomasno mlijeko se odvaja, a zatim se postupi na isti način kao kada se koristi punomasno mlijeko.
Hidrolizovano mleko (prema Bogdanovu). Uzmite 1 litar prokuvanog I obranog mlijeka ohlađenog na 45°C, postavite pH na 7,6-7,8, dodajte 0,5 g pankreatina u prahu (prethodno razrijeđenog u maloj količini tople vode) ili 2-3 g zgnječenog pankreasa i nakon nekoliko minuta 5 ml hloroforma. Nakon toga, boca se dobro protrese, dobro zatvori plutenim čepom i stavi 3 dana u termostat na temperaturi od 40°C uz svakodnevno mućkanje tečnosti. Nakon navedenog perioda, kako bi se uklonio hloroform, boca se otvori, tečnost se filtrira i razblaži 2-3 puta vodom iz slavine. Podesite pH medijuma na 7,0-7,2 i sterilišite.
Hidrolizovani mlečni agar. 1,5-2% agar se dodaje u hidrolizovano mleko, rastopi, sipa u epruvete i steriliše pod pritiskom od 0,1 MPa V 15 minuta. Bacili mliječne kiseline dobro rastu na ovoj podlozi.
Whey agar. Za 100 ml vode iz slavine uzmite 7,5 g agara, prokuhajte dok se potpuno ne rastvori, dodajte vodu do prvobitne zapremine (tj. u zapremini koja je jednaka zapremini isparene vode), dodajte 400 ml unapred pripremljene sirutke, izložite tečenju pariti 30 min, filtrirati kroz sloj vate, sipati u epruvete I sterilisati pod pritiskom od 0,05 MPa 30 minuta.
Kupus srijeda. 200 g nasjeckanog kupusa (ili lucerke) prelije se sa 100 ml vode i kuha u loncu 10 minuta, istisnuto kroz dupli sloj gaze. Dobivena tečnost se filtrira i 2 puta razblaži vodom iz slavine. Dodati 2% glukoze i 1% peptona, sipati u epruvete i sterilisati na tri viška pritiska od 0,05 MPa 15 minuta.
Osmofilni medij za rast kvasca. U približno 1 litar destilovane vode dodajte 200 g zagrejanog meda, 1 g kalijum difosfata, 0,5 g magnezijum sulfata, 0,5 g amonijum tartarata, 0,1 g natrijum hlorida i 0,1 g kalijum hlorida. Sve komponente se miješaju i steriliziraju pod pritiskom od 0,1 MPa 20 minuta.
Halofilna podloga za uzgoj. Koristite obične mesno-peptonske medije sa dodatkom 10-15 do 20-30% kuhinjske soli. Osim toga, pri proizvodnji čvrstih hranjivih podloga povećava se postotak agara. Sterilizacija se vrši pod pritiskom od 0,1 MPa u trajanju od 20 minuta.
Mediji za obogaćivanje. Mullerovo okruženje. U 4,5 g hemijski čiste krede, prethodno sterilisane suvom toplotom, dodati 90 ml MPB i sterilisati pod pritiskom od 0,1 MPa 20 minuta. Pripremiti: a) rastvor hiposulfita (50 g čistog kristalnog hiposulfita prelije se u 100 ml destilovanom vodom, sterilizira tekućom parom 30 minuta); b) rastvor joda (20 g metalnog joda i 25 g kalijum jodida se sipa u 100 ml destilovane vode). Prije sjetve, 10 ml otopine hiposulfita i 2 ml otopine joda sterilno se dodaju u juhu s kredom. Protresite smjesu kako se svaki sastojak dodaje. Sipati u sterilne epruvete ili tikvice.
Wednesday Killian. U 100 ml običnog MPB sterilno se dodaje 1 ml vodenog rastvora (1:1000) briljantnog zelenog pre upotrebe.